Sphk1对缺血性脑损伤的双重作用

【摘要】目的：研究鞘氨醇激酶1（Sphingosinekinase1，Sphk1）对缺血性脑损伤的作用机制。方法：通过线栓堵塞小鼠大脑中动脉的方法建立缺血性脑损伤再灌注动物模型(MCAO)。使用实时定量PCR（Quantitativereal-timePCR，RT-PCR）技术检测小鼠脑缺血再灌后皮层Sphk1、Sphk2和炎症因子的mRNA水平。通过免疫印迹法（Westernblotting）检测Sphk1蛋白在皮层缺血半暗带的表达情况。利用免疫荧光技术（Immunofluorescencestaining）观察在脑缺血皮层表达Sphk1的细胞类型。将小鼠在缺血再灌注后随机分成溶剂组(Vehicle)和Sphk1的抑制剂5C组，并于再灌注后3h，12h，24h，48h和72h分别给予溶剂或5C（2mg/kg），以1%2,3,5-tripheyltetrazoliumchloride（TTC）染色的方法检测小鼠在MCAO后24h和96h的脑梗死体积。使用Z-Longa评分方法观察Sphk1抑制剂对MCAO后96h神经功能的影响。使用侧脑室注射small-interferingRNA(siRNA)的方法分别特异性地抑制MCAO后Sphk1，Sphk2和TRAF-2的基因在缺血脑皮层的表达，以TTC染色法探讨Sphk1、Sphk2和TRAF-2对脑梗死体积的影响；通过检测EvansBlue外渗情况及脑内血红蛋白的含量检测Sphk1对MCAO后血脑屏障完整性的作用；以免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）研究MCAO后脑缺血皮层中Sphk1和TRAF-2的作用。结果：在小鼠MCAO模型中，鞘氨醇激酶1（Sphk1）在脑缺血的病理过程中发挥双重作用。RT-PCR结果显示：与对侧的皮层相比，在小鼠的脑皮层缺血半暗带区Sphk1mRNA被诱导表达，而脑缺血后Sphk2mRNA的水平却没有发生变化；Westernblotting显示：在MCAO的动物模型中，小鼠脑皮层缺血半暗带区Sphk1的蛋白也较对侧明显升高。免疫荧光法显示：Sphk1高表达于缺血侧皮层的半暗带区域，而且Sphk1主要与小胶质细胞和神经细胞标记共定位。TTC染色和Z-Longa神经功能评分的结果显示：Sphk1抑制剂5C、Sphk1siRNA和TRAF-2siRNA能显著降低脑缺血再灌注后的梗死体积，5C能显著提高MCAO后96h的神经功能评分。Sphk1抑制剂5C和Sphk1siRNA能显著抑制脑缺血导致的炎症因子IL-1β、iNOS、MMP9和TNF-αmRNA在缺血皮层的诱导表达。EvansBlue结果显示：Sphk1siRNA增加脑缺血后EvansBlue在脑内的渗出量；血红蛋白检测结果也发现：Sphk1siRNA增加了MCAO后脑内血红蛋白的含量。Co-IP的结果表明在皮层缺血半暗带Sphk1和TRAF-2相互结合在一起。结论：小鼠MCAO后，在皮层缺血半暗带区神经元及小胶质细胞中Sphk1被诱导表达，抑制Sphk1能降低脑梗死体积和缺血后神经炎症应答，并改善神经功能，但加剧血脑屏障的损伤和脑出血的风险。我们的研究表明Sphk1对缺血性脑损伤具有双重作用，可能是脑缺血治疗的新靶点。
【作者】郑淑立；
【导师】程坚；
【作者基本信息】苏州大学，医学神经生物学，2014，硕士
【关键词】脑缺血；大脑中动脉堵塞模型；鞘氨醇激酶1；血脑屏障；

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